江苏省产品质量监督检验研究院 曹倩文
摘要：建立了高效液相色谱法快速检测乳制品中三聚氰胺的方法。以甲醇作为三聚氰胺提取剂，乙酸锌和亚铁氰化钾作为蛋白质沉淀剂，样品经高效液相色谱进行检测，外标法定量。结果表明：当三聚氰胺标准品的添加量为2-40 mg/kg时，平均回收率为83.8-109.4%，相对标准偏差为1.2-2.2%。该方法的检出限为2 mg/kg。该方法简便快速，能够满足乳制品中三聚氰胺含量的检测工作需要。
关键词：三聚氰胺，快速检测，高效液相，乳制品
1.引言
三聚氰胺（2, 4, 6-三氨基-1, 3, 5-三嗪），是一种重要的氮杂环有机化工原料，俗称蜜胺。分子式为C3N6H6 ,结构式见图1[1]。是一种白色晶体，无毒，无味。因其含氮量高达66.7%，常被不法商人掺杂进食品或饲料中，从而大幅度降低了成本并且提升产品检测中的蛋白质，因此三聚氰胺也被称为“蛋白精”。但三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的。含三聚氰胺的食物被人或动物食用后，可导致肾衰竭，甚至死亡。2008年9月1日起，相继有媒体报道许多婴幼儿因食用某品牌奶粉而患肾结石，由此引起了国内外对三聚氰胺的高度重视。因此建立一种快速检测乳制品中三聚氰胺的分析方法是十分必要的。
目前三聚氰胺的检测方法包括气相色谱-质谱法（GC-MS）[2-3]、高效液相-二极管阵列（HPLC-DAD）[4-7] 和串接质谱（HPLC-MS/MS）[8-9]。GC-MS需要衍生化，前处理比较繁琐；HPLC-MS /MS灵敏度高、抗干扰能力强，在部分实验室作为确证方法使用；HPLC-DAD由于其前处理简单，且仪器较普及，是目前最为常见的检测方法。
本文采用甲醇：H2O作为乳制品中三聚氰胺的提取剂，建立了准确、可靠、快速的乳制品中三聚氰胺的HPLC-DAD分析方法，大量样品的分析结果表明，该方法可满足实验室日常检测工作的需要。
图1 三聚氰胺的结构式
2. 实验部分
2．1 主要仪器、试剂与标准品
高效液相色谱仪：型号为Waters2695，配有二极管阵列检测器。超声提取仪:厂商为昆山市超声仪器有限公司，型号为KQ—250DB。三聚氰胺标准品：（纯度>99.5%），Dr. Ehrenstorfer公司出品。庚烷磺酸钠，甲醇：色谱纯。实验所用其他试剂均为分析纯。
甲醇水溶液：准确量取50ml甲醇和50ml水，混匀后备用。
三聚氰胺标准储备液：准确称取100 mg（精确到0.1 mg）三聚氰胺标准品与100 mL容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/ml的标准储备液，于4°C避光保存
乙酸锌溶液：称取21.9 g乙酸锌，加3 mL冰乙酸，加水溶解并稀释至100 mL。
亚铁氰化钾溶液：称取10.6 g亚铁氰化钾，加水溶解并稀释至100 mL。
2．2 实验步骤
称取10 g乳制品（精确到0.0001 g），置于50 mL容量瓶中，分别加入30 mL甲醇，乙酸锌和亚铁氰化钾溶液各5 mL后，剧烈震荡，最后用水定容至刻度，超声提取30 min，用滤纸过滤至50ml烧杯中为待测液。用50ml的针管抽取30ml左右待测液经0.45 μm的有机微孔滤膜打入安捷伦的进样瓶，供HPLC测定。
2．3 色谱条件
色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流动相：10 mM柠檬酸、10 mM庚烷磺酸钠缓冲溶液/乙腈 = 90/10；检测波长：240 nm；流速：1.0 mL /min；柱温：30 oC，进样量：10 μL。三聚氰胺标准样品色谱图及光谱图如图2、图3所示。
图2 三聚氰胺的HPLC图谱（0.8 ppm）
Fig. 2 HPLC specture of melamine (0.8 ppm)
图3 三聚氰胺的紫外吸收图谱
Fig. 3 UV absorption specture of melamine
3. 结果与讨论
3．1 前处理条件的优化
三聚氰胺属于强极性碱性化合物，因此提取溶剂一般都选用极性较强的有机溶剂或有机溶剂和水的混合溶液。试验中选择甲醇-H2O (3：2)及乙腈-H2O (3：2)作为提取剂，比较了不同提取溶剂的提取效果，结果表明，两种有机溶剂和水混合溶液的提取效率接近。考虑到甲醇对人体的伤害相对较小且价格便宜，因此本实验选取甲醇-H2O (3：2)作为提取溶剂。
在大量的实际样品分析中发现，有一些乳制品样品在使用有机溶剂或有机溶剂和水的混合溶剂提取后十分粘稠，定容后高速离心亦无法过滤或过滤困难，且某些定容样品溶液在放置一段时间后容易出现沉淀，极易造成色谱分析柱或预柱堵塞。因此本实验选取乙酸锌及亚铁氰化钾溶液作为蛋白质沉淀剂，结果表明，该沉淀剂不仅能够有效沉淀样品中的蛋白质，同时经过该法处理的样品具有较高的回收率，结果见表1。
3．2 色谱条件的优化
三聚氰胺是强极性化合物，在普通的C18柱上保留值很低，接近于死时间流出，很难进行分析[7]。为了增加三聚氰胺在C18柱上的保留，必须选用洗脱能力非常弱的流动相，通常选用的流动相有水-甲醇、水-乙腈、醋酸铵缓冲液-甲醇、0. 1%甲酸溶液-甲醇等，这是因为含水量越高的流动相其分析物与固定相之间的疏水作用越强。由于三聚氰胺极易与C18柱上残余的硅醇基形成氢键，使得峰形拖尾，因此需要在流动相中加入辛烷磺酸钠、七氟正丁酸等离子对试剂来改善峰形[11-13]，也有研究报道在流动相中加入辛烷磺酸钠、庚烷磺酸钠或己烷磺酸钠均可以使三聚氰胺产生很好的保留[10]。本实验采用10 mM柠檬酸、10 mM庚烷磺酸钠缓冲溶液/乙腈为流动相，获得了稳定的保留时间及良好的峰形，结果如图1所示。
3．3 线性范围及检出限
配置浓度分别为0.8、2、20、40、80 μg/mL的标准工作液，按上述色谱条件进行分离，以浓度和吸收峰面积绘制标准曲线，结果如图4所示。在0. 8～80 μg/mL质量浓度范围内各物质的峰面积( Y ) 与浓度( x ) 具有良好的线性关系。线性回归方程为Y =3.811429e+004 x – 2.764287e+003，相关系数r = 0. 9999。在空白样中添加三聚氰胺标准溶液，按信噪比（S/N>10）计算，本方法的检出限为2 mg/kg。
图4 三聚氰胺标准溶液校正曲线图
Fig. 4 Calibrated curve of melamine
3．4 回收率及精密度
取经检验不含三聚氰胺的样品，分别按样品中2、4、40 mg/kg含量水平添加一定量的三聚氰胺标准溶液，每一添加浓度重复6份样品，按上述实验方法以峰面积A为纵坐标,浓度c为横坐标进行线性回归，得到2～40 mg/kg添加水平范围的回收率，以实际测定浓度的相对标准偏差表征方法的精密度。结果见表1。
表1 三聚氰胺的回收率及精密度 (n=6)
Table1 Recovery and Repeatability of melamine (n=6)
|
添加浓度（mg/kg） |
回收率/% |
RSD/% |
|
2 |
109.4 |
2.2 |
|
4 |
108.2 |
2.1 |
|
40 |
83.8 |
1.2 |
4. 结论
本文利用甲醇：H2O（3：2）提取样品中的三聚氰胺，乙酸锌和亚铁氰化钾沉淀样品中的蛋白质，建立了高效液相色谱法检测乳制品中三聚氰胺的快速方法。该方法具有前处理简单，重复性好等特点，适合乳制品中三聚氰胺的快速检测。
参考文献
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作者：曹倩文,工程师
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